1、整個操作要在潔凈通風的超凈臺下進行,所有的器材要高壓消毒。
2、根據BALB/c小鼠的體重,用10ml/kg3%濃度的麻醉;將小鼠置于盛有75%乙醇的燒杯內,這一步不僅可以消毒,也可以讓小鼠體毛浸濕,后續剃去皮毛的時候不會沾到剪刀或組織上。
3、用鑷子輕輕挑起小鼠的心臟,裝有PBS的注射器插入心尖,同時在右心耳處剪開一個小口,緩慢推動注射器,隨著心臟的跳動,將體內的血液沖洗出來。
4、取出小鼠的肺部組織,小鼠ELISA試劑盒將肺組織切成小米粒樣的大小,置于預冷的HBSS中反復沖洗幾次。
5、將小米粒大小的肺組織置于培養瓶中(培養瓶前一天用1%明膠溶液包被培養面,4度過夜,小鼠處理前,將培養瓶放置培養箱中,使其溫度恢復至37度),置于培養箱37度的環境下,消化4個小時。
6、消化4小時后,加入RPMI1640培養基(有10%血清、1%雙抗、1%內皮細胞生長因子)10ml(添加培養基,可以是正常培養時的2倍量),繼續培養24小時(繼續培養的時間可根據細胞貼壁情況適當調整)。
7、24小時后,取出肺組織,鏡下觀察細胞狀態,換液。
8、小鼠酶聯免疫檢測試劑盒的提取和培養是很慢的過程,一般需等到24小時后,才能在鏡下看到些許細胞群,一周到兩周后才會看到鵝卵石樣的排列情況。
9、小鼠酶聯免疫檢測試劑盒2-3天換液一次,因為內皮細胞生長形成單層時,會出現接觸抑制現象。所以,內皮細胞生長接近單層時就可以傳代了,不要等到長得非常滿。
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