在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在ELISA試劑盒中似不恰當。
抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。
這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA試劑盒反應總是需要一定時間的溫育。
溫育常采用的溫度有43 ℃、37 ℃、室溫和4 ℃（冰箱溫度）等。37 ℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA試劑盒方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37 ℃經1-2小時，產物的生成可達ding峰。
為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43 ℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4 ℃更為*，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA試劑盒中一般不予采用。
保溫的方式除有的ELISA試劑盒儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA試劑盒板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。
若用保溫箱，ELISA試劑盒板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA試劑盒板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。
室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25 ℃，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA試劑盒板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。
