操作步驟:
1. 準備:無水乙醇、異丙醇、PBS 及 1.5mL 離心管。
2. 取出洗滌液,按終濃度 70%比例加入無水乙醇,如7.8mL 加入18.2mL 無水乙醇,充分混勻。
3. 菌體處理:將收集的細菌或真菌 5,000 rpm 離心3分鐘,棄上清,加入 200μLPBS,振蕩混勻,5,000 rpm 離心3分鐘,充分棄上清。
4. 加入100 μL 裂解液Ⅰ,強烈 Vortex,直到沉淀至懸浮,無明顯塊狀沉淀,再加入裂解酶 10μL,充分混勻,室溫放置 20 分鐘。
5. 加入200 μL 裂解液Ⅱ,20μL 復合消化液,充分混勻,65℃孵育 20 分鐘。
6. 加入450μL 異丙醇,輕輕顛倒混勻,如有半透明懸浮物,不影響 DNA 的提取與后續實驗。
7. 將吸附柱放入收集管內,將上述溶液全部轉入吸附柱內,12,000 rpm 離心1分鐘,棄收集管內廢液。
8. 將吸附柱放回收集管內,加500μL 洗滌液至吸附柱內,靜置 2 分鐘,12,000 rpm 離心 1 分鐘,棄收集管內廢液。
9. 將吸附柱放回收集管內,加500μL 洗滌液至吸附柱內,12,000 rpm 離心 1 分鐘,棄收集管內廢液。同時,按每份樣本 40μL 取洗脫液(如 10 份提取樣本,即取 400μL 洗脫液),放置于滅菌 1.5mL 離心管,65℃預熱。
10. 將吸附柱放回收集管內,12,000rpm 離心 2 分鐘,離去殘留的洗滌液。
11. 取出吸附柱,放入新的 1.5mL離心管內,加入上述預熱的40μL 洗脫液,靜置 2 分鐘,12,000rpm離心 2 分鐘,收集 DNA 溶液。提取的 DNA 即可用于下一步實驗或-20℃保存。
注意事項:
1. 裂解液、洗滌液含有刺激性化學物質,操作過程請做好防護措施,避免直接接觸皮膚,防止吸入口鼻。如不慎沾染皮膚或眼睛,請立即用清水或生理鹽水沖洗,必要時請就醫。
2. 洗滌液最好現用現配,按需計算用量后配制。加入乙醇后的洗滌液如使用不完,2-8℃密封保存不超過 1 周。
3. 細菌量建議不高于 10^7 。