ELISA法HBsAg假陽性和假陰性
為了減少HBsAg檢測出現假陽性和假陰性,我們有必要對這種現象的原因進行分析,在實際的檢測工作中,造成HBsAg檢測出現假陽性和假陰性主要受以下因素影響,分述如下:
一、ELISA法假陰性原因
1. 標本用肝素或EDTA等抗凝處理易造成HBsAg檢測結果假陰性,肝素抗凝血漿會增加OD值,可能與高濃度肝素具有強大的負電荷,能吸附酶標記物不易洗脫有關;EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA系統中的辣根過氧化物酶活性,造成假陰性。
2. 標本保存不當,在冰箱內保存過久的標本,血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體。標本放置時間延長(如一天以上),有時抗原或抗體免疫活性減弱,便出現假陰性。因此若采血后不能及時檢測,5天內檢測標本分離血清置于4。C冰箱內;超過5天不能檢測的,應放在-20。C低溫冰箱中。
3. 低濃度HBsAg標本(弱陽性HBsAg)易受加樣時間(特別是大批量標本)、試劑平衡時間、溶血程度的影響,出現假陰性。如加樣時間在30分鐘內的差異是zui大的。
4. 高濃度HBsAg在ELISA一步法檢測中易出現假陰性,即HBsAg的鉤狀效應。從原理來講,一步法中HBsAg與包被板上的HBsAb及酶結合的HBsAb結合是雙向的,當HBsAg濃度過高時,HBsAg與包被板上的抗體及酶結合物中的抗體均是單向結合,不能形成抗體-抗原-抗體酶復合物,使酶標記抗體在隨后的洗板中洗掉,從而顯出陰性結果。但是在ELISA兩步法中,高濃度的HBsAg只能與包被的HBsAb“飽和"地結合,多余部分被洗掉,隨后加入的酶結合的HBsAb正好通過HBsAg的“橋梁"作用而結合在酶標板上,顯示陽性結果。因此當HBsAg強濃度時用ELISA一步法檢測存在假陰性現象。解決此問題的zui hao辦法有:對標本進行稀釋;不單檢測HBsAg;采用ELISA兩步法檢測可消除漏檢現象。
5. 由于慢性病毒攜帶者(低水平HBsAg攜帶者)或HBV感染的潛伏期,HBsAg濃度低于檢測水平的下限,由此造成假陰性。
6. S基因突變導致HBsAg的氨基酸結構改變,由于多數商用試劑盒檢測系統采用的為多克隆抗體檢測HBsAg的a決定簇,這一區域的點突變即可導致臨界觀測值或陰性結果,造成假陰性。
二、ELISA法假陽性原因
1. 溶血或紅細胞:有國內報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性,因紅細胞破壞溶解時釋放出大量血紅蛋白,血紅蛋白的亞鐵血紅素具有弱過氧化物酶活性,其作用效應與辣根過氧化物酶(HRP)類似,能與預包被抗體(Ab)結合,一步法洗脫步驟往往難以wan全洗脫,殘留的過氧化物酶催化底物四甲基聯苯胺(TMB)產生假陽性。因此在采集血標本時,量不能太少,操作過程中如果血清混濁,一定要離心后再吸樣,避免紅細胞加入造成假陽性。對于溶血的標本zui重新采集血液,進行重新檢測。
2. 標本凝集不全或標本離心處理時采用不同的離心轉速和離心時間,也可造成假陽性結果。若在血液還未開始凝固時即強行分離血清,此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,易造成假陽性結果;離心轉速過低或離心時間過短,由于血液離心不充分均可導致假陽性。解決的辦法zui是血液標本采集后放水浴箱,使其充分凝固再用3000rpm,離心15分鐘再分離血清。
3. 干擾物質的影響:如類風濕因子(RF)、補體、AFP等可以造成HBsAg檢測結果假陽性。RF因子可與標記二抗的Fc段結合造成假陽性;補體從C1q活化,使一抗和酶標二抗的抗體分子發生變構,Fc的C1q分子結合點暴露出來,則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性,采用56。C30分鐘滅活補體可降低假陽性率;高濃度的AFP(如孕婦),在儲存過程中可能形成二聚體會導致本底過深造成假陽性結果。
4. 某些細菌污染標本(如表皮球菌等),菌體中可能含有內源性HRP,造成檢測結果假陽性。