1、引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。
DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因,通過序列分析軟件(比如DNAman)比對(Alignment),各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。
2、引物長度一般在15-30堿基之間。
引物長度(primer length)常用的是18-27bp,但不應(yīng)大于38bp,因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA 聚合酶進行反應(yīng)。
3、引物GC含量在40%~60%之間,Tm值最好接近72℃。
GC含量(composition)過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度,一般高于Tm值5-10℃。
若按公式Tm=4(G+C+2(A+T)估計引物的Tm值,則有效引物的Tm為55-80℃,其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。
4、引物3'端要避開密碼子的第3位。
如擴增編碼區(qū)域,引物3'端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第3位易發(fā)生簡并,會影響擴增的特異性與效率。
5、引物3'端不能選擇A,最好選擇T。
引物3'端錯配時,不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異,當(dāng)末位的堿基為A時,即使在錯配的情況下,也能有引發(fā)鏈的合成,而當(dāng)末位鏈為T時,錯配的引發(fā)效率大大降低,G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間,所以3'端最好選擇T。
6、堿基要隨機分布。
引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高,尤其是3’端相似性較高的序列,否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)(False priming)。降低引物與模板相似性的一種方法是,引物中四種堿基的分布最好是隨機的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。
7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列。
引物自身不應(yīng)存在互補序列,否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。
兩引物之間也不應(yīng)具有互補性,尤其應(yīng)避免3'端的互補重疊以防止引物二聚體(Dimer與Cross dimer)的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。
引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話,應(yīng)盡量使其△G值不要過高(應(yīng)小于4.5kcal/mol)。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶,并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進行。
8、引物5'端和中間△G值應(yīng)該相對較高,而3'端△G值較低。
△G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能,它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性,△G值越大,則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5' 端和中間△G值相對較高,而3'端△G值較低(絕對值不超過9)的引物。引物3'端的△G 值過高,容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(不同位置的△G值可以用Oligo 6軟件進行分析)。
9、引物的5'端可以修飾,而3'端不可修飾。
引物的5' 端決定著PCR產(chǎn)物的長度,它對擴增特異性影響不大。因此,可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5'端修飾包括:加酶切位點;標(biāo)記生物素、熒光、di高辛、Eu3+等;引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列;引入點突變、插入突變、缺失突變序列;引入啟動子序列等。
引物的延伸是從3'端開始的,不能進行任何修飾。3'端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。
10、擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。
某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響,選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件(比如RNAstructure)可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu),有助于選擇模板。實驗表明,待擴區(qū)域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol時,擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時,用7-deaza-2'-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。
11、引物應(yīng)具有特異性。
引物設(shè)計完成以后,應(yīng)對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性,就可以進行下一步的實驗了。
值得一提的是,各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難,例如GC含量偏高或偏低,導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物;用作克隆目的的PCR,因為產(chǎn)物序列相對固定,引物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次,盡量去滿足條件。
做Real Time時,用于SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計的要求:
1)避免重復(fù)堿基,尤其是G。
2)Tm=58-60度。
3)GC=30-80%。
4)3'端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C.
5)正向引物與探針離得越近越好,但不能重疊。
6)PCR擴增產(chǎn)物長度: 引物的產(chǎn)物大小不要太大,一般在80-250bp之間都可;80-150bp最為合適(可以延長至300 bp)。
7)引物的退火溫度要高,一般要在60度以上;
12、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。
而且引物設(shè)計時應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力,即引物應(yīng)該跨外顯子,最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū),這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。
至于設(shè)計軟件,PRIMER3、PRIMER5、PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的。
做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對于引物,你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準(zhǔn)備-尋找合適的引物非常不容易。
關(guān)于BLAST的作用應(yīng)該是通過比對,發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計的這個引物,在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并在GENEBANK中公開的不物種基因序列當(dāng)中,除了和你的目標(biāo)基因之外,還有沒有和其他物種或其他序列當(dāng)中存在相同的序列,如和你的目標(biāo)序列之外的序列相同的序列,則可能擴出其他序列的產(chǎn)物,那么這個引物的特異性就很差,從而不能用。